论文解读：无乳链球菌粘附和入侵罗非鱼肠粘膜体外模型的形态学特征

链球菌病是罗非鱼主要的细菌性疾病，由无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）和海豚链球菌（Streptococcus iniae）感染引起。感染的罗非鱼通常表现为翻转或转圈游泳、眼球突出，眼眶充血，腹部膨大，肛门红肿。组织病理学表现为鳃充血，肾脏受损、肿大、白细胞浸润，肝脏颗粒变性，肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜上炎性白细胞浸润，眼睛脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死等。
   目前比较被认同的一种观点是，无乳链球菌通过口腔进入罗非鱼胃和肠道引发感染。今天给大家带来的这篇文章，就是直观地向大家展示无乳链球菌是如何黏附并侵染罗非鱼肠道粘膜，引用信息如下：


研究结果如下：
1、用含有10%BSA的DMEM培养基离体培养罗非鱼肠道，在宏观上保证肠道器官的管状三维结构，并可以稳定维持120min（图1）。在240min后出现坏死现象（图2）

图1 健康罗非鱼肠道体外培养，120min（H&E染色，100X）；图2 健康罗非鱼肠道体外培养，240min（H&E染色，100X）

2、研究无乳链球菌对罗非鱼肠粘膜粘附和侵袭的形态学特征
1）确定无乳链球菌最佳浓度和孵育时间：109CFU/mL浓度下孵育40min

图3 无乳链球菌黏附性与细菌浓度，孵育时间关系

2）无乳链球菌在20min的时候开始出现肠道内腔中，于40min聚集于肠上皮细胞中（图4），并呈现链状和团状结构，核杂质和常染色质的清晰分化以及核仁的存在说明了肠上皮细胞状态良好，但是粘液细胞几乎没有产生应答（星号所指），箭头所指为上皮内淋巴细胞。

图4 无乳链球菌感染罗非鱼肠道40min（H&E染色，1000X）

3）通常情况下，无乳链球菌体表会覆盖棉花装的荚膜结构。本研究中，通过透射电镜（MET）观察，无乳链球菌黏附的过程中，其荚膜消失了，或者仅仅留了一下部分在黏附接触面的另一侧（图5），并且一旦附着于上皮细胞的微绒毛，无乳链球菌会互相分离，解除链状结构（图6），此外，无乳链球菌甚至会和微绒毛的尖端连接在一起（图7）。

图5 MET 28000X；图6 MET 32000X；图7 MET 28000X

4）无乳链球菌侵染肠道外植体，外植体粘膜层发生转变。无乳链球菌附着于肠壁，大量集中在肠道外植体折叠处的顶端部位（图8），在侵染过程中，无乳链球菌进入罗非鱼肠固有层的主要途径是通过上皮细胞，但是该过程不是由单个链球菌引起，而是一群链球菌参与其中（图9），当进入肠上皮细胞的胞质内，链球菌仍是无荚膜包裹状态，并能继续分裂复制（图10）。    

图8 无乳链球菌集中于肠道折叠处      

图9 大量无乳链球菌穿过上皮细胞

图10 肠细胞胞浆中含有多个游离无乳链球菌，其中一些处于分裂状态(箭头)

结论：无乳链球菌的黏附和侵染主要开始于肠道折叠处的顶部，在感染早期阶段，无乳链球菌会需要褪去荚膜，才能与肠道上皮细胞发生作用，而这种现象在链球菌属是普遍存在的。在本实验无乳链球菌黏附，侵染至固有层过程中，粘膜细胞与淋巴均没有产生免疫应答，并且大量链球菌存在于肠细胞的胞质内，这些细胞也没有出现明显的病变死亡。